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“挪一挪，海阔天空“ | 侧翼探针妙用
2021-10-29
在液相基因芯片的设计中，InDel是较难检测的一类变异，例如EGFR的19号外显子的Deletion，20号外显子的Insertion；此外，广义上，一些MSI变异也属于InDel变异，准确检测InDel变异对于疾病诊疗具有重要意义。值得注意的是，相较于SNV变异，InDel变异具有更强的区分度，作为MRD的分子标记，在低频突变检测中更具优势。因此，要更有效的检出InDel变异，需要对常规的探针设计方式进行优化调整。
如图1A所示，由于文库片段的随机分布，一条探针（孤儿探针）与目的片段的捕获率会随着结合长度的减小而减低（边缘效应）。因此，增加目标区域侧翼探针覆盖，能够有效弥补孤儿探针的边缘效应所丢失的有效拷贝，这一点，在探针饱和时，提高GC异常区域的覆盖非常有效（图1B）。
图1.侧翼探针对覆盖的影响
同样的道理，对于InDel的检测，将探针左右各挪动60bp，利用侧翼探针进行捕获，其效果也是非常明显。对已知等位基因频率为的InDel变异位点分别设计野生型（WT）、侧翼（FLK）和突变型探针（Mut），分别对阴性和阳性gDNA样本进行杂交捕获后测序分析。以等位基因频率为1%左右的EGFR Exon19Del（15bp）为例，如图2所示，在覆盖深度方面，加入FLK探针后，两种样本的相对覆盖深度提高20%左右，与预期一致；对于等位基因频率检测，与单独使用WT探针相比，加入FLK探针后，等位基因频率从50%提升至100%，较WT探针提升一倍，效果明显。此外，加入Mut探针的检测结果与WT+FLK探针表现相近，表明WT+FLK的组合已经能够较为饱和的捕获变异片段。
图2.不同探针设计对EGFR Exon19Del的覆盖深度和等位基因频率
（野生型样本中EGFR?Exon19Del等位基因频率为0，本图只展示阳性样本）
在MSI位点覆盖方面，侧翼探针同样有效，如图3所示，分别以5个MSI位点（BAT26、NR24、BAT25、NR27和NR21）为中心设计野生型探针（WT）和侧翼探针（FLK），采用WT和WT+FLK探针分别进行捕获测序。在覆盖深度方面，对于5个MSI位点，WT+FLK较WT探针均能提升2倍左右的深度覆盖，达到与整体Panel平均深度接近的水平。
图3.侧翼探针提升MSI区域覆盖
通过上面的数据我们发现，侧翼探针不但能够提升的目标位点的深度覆盖，同样能够提高InDel位点的检测效果；此外，侧翼探针在融合基因检测方面的效果与此类似，不再赘述。因此，伯科探针设计流程通常采用1.5 x Tiling，即保证了变异检出，又为用户节省了成本。尤其是在检测低频挑战区域的时候，其表现会更加稳定。值得一提的是，在超低频ctDNA的检测中，基因组拷贝数和片段长度（~160bp）是更大的挑战，伯科将在相关领域深入研发，为用户带来更好的解决方案。
